1. История возникновения и развития методов генотипоскопии

Отправлено 5 нояб. 2012 г., 16:18 пользователем Неизвестный пользователь   [ обновлено 5 нояб. 2012 г., 16:18 ]
Важное значение в расследовании преступлений, объективизации доказывания по уголовным делам имеют объекты биологического происхождения. Все биологические объекты, происходящие от человека,— кровь, сперма, фрагменты органов и тканей, волосы, ногти с подногтевым содержимым, слюна, потожировые наслоения, зубы, кости и т. д., являются предметом исследования судебно-медицинской экспертизы. Для этого используются различные методы: серологический, цитологический, гистологический, биохимический, химико-токсикологический, физико-технический и др.
1985-й год вошел в историю судебной медицины как год появления принципиально нового — молекулярно-генетического метода, объектом исследования которого стала ранее не входившая в число традиционных биологических объектов молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
Современный уровень знаний о молекулярной биологии и ДНК обусловлен теоретическими и экспериментальными достижениями в фундаментальных областях науки — классической генетике, биохимии и других. ДНК — сложное химическое соединение, давно была открыта в ядре клетки, но ее функция как хранителя наследственной информации оставалась неизвестной. И только в 1953 г., когда Уотсон и Крик постулировали двухспиральную структуру и предложили ее трехмерную модель, появилась и стала бурно развиваться новая самостоятельная наука — молекулярная биология. С ее возникновением появились способы познания природы на субмолекулярном уровне. 
Молекула ДНК является хранителем наследственной генетической информации человека. По внешнему виду — это тончайшая цепочка, звеньями которой являются химические вещества — нуклеотиды. Их всего четыре типа: аденин, гуанин, тимин и цитозин. Таких звеньев (нуклеотидов), образующих одну молекулу ДНК,— 3 х 109. Зная размер одного нуклеотида, установили, что общая длина ДНК в ядре клетки около двух метров. И все многообразие живущих на Земле видов живых существ и их индивидуальные отличия внутри каждого вида обусловлены бесчисленным множеством комбинаций этих нуклеотидов.
В начале 80-х годов в молекуле ДНК человека были обнаружены участки, обладающие структурным полиморфизмом, т. е. у каждого человека по своему строению они уникальны. Такие участки были названы вариабельными тандемными повторами (ВТП). В 1985 г. генетиком Лестерского университета (Англия) А. Джеффрисом разработан метод генной идентификации лич-ности, в последствии названный ДНК-фингерпринтом (от англ. fingerprint — отпечаток пальца) или генной дактилоскопией (в настоящее время чаще употребляют термин “генотипоскопия”). Но, в отличие от отпечатка пальца в криминалистическом понятии, метод ДНК-фингерпринта позволяет не только идентифицировать личность. Джеффрис обратил внимание на свойства ВТП, которые позволили шире использовать эти участки ДНК в судебной медицине: прямое наследование ВТП от родителей к детям используется для установления кровного родства; соматическая стабильность (абсолютное тождество ВТП во всех клетках у одного и того же человека) используется при установлении принадлежности частей тела одному или не-скольким трупам; наличие у мужчин и женщин половых Х- и У-хромосом позволяет установить генетический пол биологических объектов; уникальность ВТП используется для идентификации личности, т. к. практически невозможно встретить двух человек (кроме монозиготных (однояйцевых) близнецов), имеющих одинаковую структуру молекулы ДНК. Подсчитано, что метод позволяет выделить одного человека из 100 миллиардов. Благодаря своей точности метод сразу приобрел сенсационный успех, поэтому быстро был внедрен в судебно-медицинскую практику. Уже в 1987 г. британский суд впервые принял генетическую экспертизу в качестве доказательства при установлении спорного отцовства. В том же году рассматривалось уголовное дело об изнасиловании и убийстве двух девушек, где экспертом выступал сам А. Джеффрис. В 1988 г. в США (штат Колорадо) был принят закон о ДНК-тестировании рецидивистов и сексуальных маньяков перед освобождением из тюрьмы.
В нашей стране развитие этого метода началось с 1988 г. на базе НИИ молекулярной биологии в Москве. Большой вклад в эту работу внесли российские ученые А. Б. Рысков, А. Г. Джин-чарадзе, П. Л. Иванов, С. А. Лимбарский, М. И. Просняк. Первая экспертиза по уголовному делу с применением данного метода была проведена в 1989 г.
В 1990 г. метод был внедрен в практику Бюро судебно-медицинской экспертизы Ленинграда. Почти одновременно подобные работы были начаты в Новосибирске, Вильнюсе, Минске.
В настоящее время целый ряд лабораторий различных регионов России, часть которых не входит в состав судебно-медицинских учреждений, применяют молекулярно-генетические методы исследования в целях судебной медицины (лаборатория при Республиканском центре судебно-медицинской экспертизы, Экспертно-криминалистический центр МВД РФ, Волгоградский ветеринарный институт и др.).
Метод генотипоскопии, как и все другие методы, применяемые в судебной медицине, имеет недостатки. Однако многие проблемы были решены после появления способа исследования ДНК, основанного на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Способ ПЦР предложил сотрудник химической корпорации “Цетус” (США) К. Мюллис. Идея и ее воплощение на первый взгляд просты. Основа метода в том, что в микропробирках, используя специальные реагенты и аппараты — программируемые термоциклеры, можно получить миллионы копий интересующих участков ДНК. ПЦР позволяет использовать в качестве стартовой матрицы ничтожно малое количество ДНК, причем с высокой степенью деградации, т. е. нарушением структуры.
В нашей практике были получены результаты при работе с пятнами крови и спермы диаметром 2—4 мм и несколькими волосяными луковицами. Более крупные пятна крови имели давность 2,5 года, пятна спермы — около 4-х лет.
При исследовании тампонов с содержимым влагалища ДНК получают, используя методику дифференциального лизиса клеток. Это позволяет отделить ДНК спермы от ДНК сопутствующих клеток женского происхождения и избежать возможной ошибки.
Способ ПЦР реализуется в три этапа: получение ДНК из биообъектов, собственно ПЦР и анализ продуктов реакции с помогаю электрофореза.
В нашей практике длительность экспертизы составляет в среднем 2—4 недели. Однако использование зарубежных экспресс-систем для получения ДНК, наличие достаточного парка термоциклеров и мощных комплексов для электрофореза с компьютерной обработкой результатов позволит в будущем выполнить экспертизу за 3—5 дней.
Ранее типирование ДНК проводилось способом гибридизации, включающим в себя более десяти этапов, в том числе и радиоактивные работы с короткоживущими изотопами. При этом каждый этап длился сутки и более. Поэтому сроки исследования затягивались на 1—1,5 месяца. В настоящее время этот трудоемкий, сложный и вредный для здоровья способ используется редко.

Сравнение способов генотипоскопии

 
Гибридизация
Полилокусные
зонды 
 Гибридизация
Монолокусные 
зонды
 ПЦР
Микросате-
литы
Информативность ++++ ++ + 
Простота исследования + ++  ++ 
Простота сравнения и архивирования  + + 
Исследование деградированной ДНК    +
Исследование смеси ДНК  _   +++ 
 Устойчивость к загрязнению+  +